Justin Chambers wurde am 11. Juli 1970 in Springfield, in Ohio, geboren. Er hat einen Zwillingsbruder (Jason), einen älteren Bruder und zwei ältere Schwestern.
Als Justin für Clavin Klein als Model gearbeitet hat, lernte er seine Frau Keisha kennen, welche dort in der Model Agentur arbeitete.
1997 wurde ihre erste Tochter (Isabella) geboren. Es folgten die Zwillinge Maya und Kaila (1999) und ihre Tochter Eva (2001) sowie der Jüngste, Jackson.

Seine Schauspielkarriere begann mit einer kleinen Rolle in einer Serie (1995), gefolgt von einigen anderen TV-Produktionen. Sein erster Kinofilm war Wedding Planer (2001) gefolgt von Gastauftritten in Serien wie Cold Case.